骨质疏松症是一种以骨强度受损为特征的骨骼疾病。其病因很多,最终结果为成骨过程低于破骨过程,骨量和骨质量下降。成骨细胞是骨质生发、形成的物质基础,只有其不断的分裂增殖才可以产生丰富的胶原基质,通过矿化作用形成更多骨质。通过刺激成骨细胞增殖、促进骨组织形成是治疗骨质疏松的主要方法之一。有研究认为虎骨能增加骨质疏松大鼠的血钙水平、提高骨密度、增加骨强度及韧性,同时减少骨吸收,这些作用与天然虎骨一致。但人工虎骨促进成骨作用的细胞机制尚未明确。金天格胶囊的主要成份为人工虎骨粉。本研究观察金天格胶囊对成骨细胞的影响,探讨其对成骨细胞作用的机理。
细胞培养:采用改良的胰酶.胶原酶序贯消化法培养人成骨样细胞。骨科手术取成人(30~50岁无骨代谢疾病的
骨折患者)的松质骨l一2 g,去除外膜结缔组织,剪成2mm 大小碎粒,用胎牛血清(PBS)冲洗3次,用0,25%胰酶.ED—TA 37℃消化两次,每次20min,弃去消化液,继用l mg/ml IV型胶原酶于37~C消化5次,反复振摇,每次20min,弃除前两次消化上清液,取最后3次消化液,离心(1200fmin)10min,弃上清液后用含l5%PBS的MEM 培养液重悬细胞,接种于75cm~75cm培养瓶,于37℃,25%CO 条件下培养,次日换液弃去悬浮细胞,每隔两日换液1次;消化后的骨碎片可贴于25cm~25cm培养瓶壁(25—40个碎骨粒/瓶),加入含15% PBS的MEM 培养液,37~C,25%CO 条件下培养,l周后换液,以后隔两日换液1次,即得到酶消化法及骨片贴附法所获得的人成骨样细胞(HOB)。
细胞鉴定:采用倒置显微镜和电镜进行形态学观察,采用改良Gomon钙一钴法做碱性磷酸酶染色。
药液配制:应用金天格胶囊(金花企业股份有限公司高新制药厂生产)lg,加入含l5%PBS的MEM培养液(pH值为7.3.7.4,过滤除菌)lOml中,用0.451~m滤器除菌,配成浓度为0.1g/ml的溶液。依上法可配制成浓度为5p~g/ml、10l~g/ml、20~g/ml的金天格胶囊药液。
统计方法:定量指标用均数±标准差表示。采用x 检验或t检验,P<0.05为有统计学意义。
结果:细胞形态观察用酶消化法获得的HOB,倒置显微镜下观察,呈纺锤形、多边形及梭形,呈”铺路石ll{羊排列,局部有密集的细胞团。电镜下观察,呈类圆形,表面有微绒毛突起,细胞中富含较多线粒体、扩张的粗面内质网及大量的分泌空泡,细胞膜下可见丰富的颗粒状电子致密物,细胞核较大,可见核膜内陷及大的核仁。符合成骨细胞特点。
细胞染色:碱性磷酸酶染色细胞胞浆内有棕黑色沉淀并掩盖细胞核上,染色呈强阳性,符合成骨细胞特点。
药物作用效果:在不同药物浓度下观察各指标结果上表显示金天格胶囊药液可以明显刺激成骨细胞的增殖,与不用药组对比有显著差异,并随药物浓度的增加,成骨细胞数明显增多(P<0.05);反映成骨细胞活性的AKP、BGP随药物浓度的增加也相应升高,与不用药组对比有显著差异(P<0.05);反映破骨细胞活性的PYD则随药物浓度的增加而相应下降,与不用药组对比有显著差异。
本研究联合检测金天格胶囊药液干预试验后的AKP、BGP、PYD的含量并进行细胞计数,结果表明加药后细胞数随药物浓度增加而增加,AKP、BGP水平也相应提高,Ⅲ组的AKP、BGP水平较I组和II组增加明显,与不用药组对比存在统计学差异(P<0.05),说明金天格胶囊有直接刺激成骨细胞增殖及加强其活性的作用,并且提高金天格胶囊的浓度(用量)有利于药效的发挥。再者,标本检测中发现的PYD,可能是成骨细胞传代过程中部分细胞破坏,释放某种物质降解胶原产生的,本研究显示加大金天格胶囊药液的浓度可使培养液中PYD的浓度下降(P<0.05),这说明金天格胶囊也有抑制破骨的作用。金天格胶囊的原料药来自动物骨骼,含丰富的骨胶原蛋白,是参与骨形成的重要有机基质翻,同时还含有参与骨形成的重要无机基质。本研究显示金天格胶囊直接刺激成骨细胞增殖及加强其活性的作用可能是所含的骨胶原蛋白、钙、磷及微量元素等共同作用的结果。
(本文节选自《金天格胶囊对成骨细胞作用的研究》)